昱宇等团队评估单碱基编辑器在灵长类动物个体水平的脱靶效应

责编｜酶美

单碱基编纂器（base editors）是潜在治疗由点突变发生的遗传性疾病最有用和准确的办法。因为可以或许在不依附 DNA 双链断裂（DSB）的环境下实现对单个碱基的定向改动，单碱基编纂器可以或许最年夜限度的削减基因编纂中不良产品的发生。比来的研讨已经胜利地将单碱基编纂器用于小鼠和猴等疾病模子的治疗，胜利修复了致病基因并改善了机体康健【1-3】。然而单碱基编纂器依然存在必定的脱靶效应，并由此带来潜在的平安性问题。因为个别之间单核苷酸多态性（SNP）的存在，单碱基编纂器的脱靶效应的评估依附于高敏锐度的检测技术，同时必要有严厉的对比样本，能力够从全基因组测序数据中辨认出非 sgRNA 依附的脱靶突变。2019 年，Science杂志上颁发的两篇文章分离用分歧的办法在水稻和小鼠上证实了单碱基编纂体系存在严重的脱靶效应【4, 5】。灵长类动物在遗传和心理上与人类高度类似，可为基因编纂对象平安性的评估提供紧张数据。然而，因为资本和技术的限定，对付单碱基编纂体系在灵长类个别程度的脱靶阐发尚无有用计划。

2022 年 7 月 22 日，昆明理工年夜学灵长类转化医学研讨院牛昱宇传授和季维智院士领衔的研讨团队在Science Advances杂志在线颁发论文Cloning and base-editing of GFP transgenic rhesus monkey and off-target analysis。该研讨基于体细胞核移植（SCNT）技术，树立了一种实用于灵长类动物的单碱基编纂器脱靶检测办法 OA-SCNT。研讨职员应用该办法对腺嘌呤单碱基编纂器 ABEmax （ABE7.10的优化版本）【6】在猕猴胚胎 DNA 、RNA 程度的脱靶效应进行了体系评估（图1）。此项事情是初次在不借助于脱靶位点猜测技术的环境下，在灵长类动物个别程度进行的单碱基编纂器的脱靶阐发，为其在将来人类疾病治疗中的利用提供了紧张参考。

图1. OA-SCNT办法示意图。

研讨职员以一只表达绿色荧光卵白（GFP）的成年转基因猕猴的体细胞核作为供体，采纳SCNT办法构建克隆胚胎，在胚胎早期阶段应用单碱基编纂缄默 GFP 表达，并经由过程胚胎移植办法得到克隆猴，这也是首只起源于成年转基因猕猴并以单碱基编纂办法胜利实现基因修饰的克隆猴（图2）。同时，研讨者网络了包括克隆胚胎和克隆猴成体组织在内的样本进行全基因组和转录组测序，进而完成 DNA、RNA 程度的脱靶阐发。因为细胞核来自统一只动物，编纂组和对比组胚胎的基因配景完全同等，经由过程比对两者之间的差别便可判定出由基因编纂对象造成的突变。

图2. 联合体细胞核移植与单碱基编纂办法得到的克隆猕猴。

在基因组程度，研讨职员综合四种算法对样本间 SNVs 进行辨认，以供体细胞为参考，在编纂组样本中判定出脱靶突变。阐发成果注解，无论从 SNV 总数照样特异的 A>G和T>C 突变数目来说，编纂组与对比组均没有明显差别，阐明 ABEmax 体系并没有引起显著的 DNA 脱靶编纂，这一点与小鼠胚胎的成果相似【4】。在 RNA 脱靶阐发中，编纂组的猕猴胚胎中呈现了明显增长的 SNVs，且绝年夜多半为 A>G和T>C 突变，注解 ABEmax 会引起年夜范围的 RNA 脱靶编纂。在基因表达总体程度相称的环境下，脱靶突变革多产生在表达量相对较高的基因，而且随机散布在分歧的转录本中。此外，阐发数据注解，98% 以上的脱靶突变产生在卵白编码序列，仅 1.9% 为长链非编码 RNA（lncRNAs）。研讨者进一步评估了 RNA 脱靶突变的基因与胚胎早期发育症结基因的关系，发现每个胚胎中均匀有392 个脱靶编纂突变产生在与胚胎早期发育相关的基因，但对基因表达量没有影响。此外，每个编纂组胚胎样本中均匀有 109 个脱靶编纂位点与致癌基因或抑癌基因相关，同样，这些基因的表达量与对比组相比没有明显变化，但其编码卵白序列有可能被转变。

综上，该研讨初次胜利实现了成年转基因猕猴的克隆和单碱基编纂，并以此为根基树立了灵长类动物单碱基编纂脱靶阐发办法，研讨发现 ABEmax 可以在灵长类动物中诱导普遍的 RNA 脱靶突变，并有可能对胚胎早期发育发生影响或具有潜在致癌性。该研讨初次实现了灵长类个别程度的单碱基编纂脱靶效应评估，将为精准基因编纂对象的开发、优化以及临床前利用的平安性评估提供紧张参考。

昆明理工年夜学牛昱宇传授、季维智院士为本文通信作者，康宇博士、代绍兴副传授，王芳博士、博士生曾玉强为文章的并列第一作者。

https://science.org/doi/10.1126/sciadv.abo3123

制版人：十一

参考文献

1. Rothgangl T, Dennis MK, Lin PJC, Oka R, Witzigmann D, Villiger L, Qi W, Hruzova M, Kissling L, Lenggenhager D et al: In vivo adenine base editing of PCSK9 in macaques reduces LDL cholesterol levels.Nature biotechnology2021, 39(8):949-957.

2. Musunuru K, Chadwick AC, Mizoguchi T, Garcia SP, DeNizio JE, Reiss CW, Wang K, Iyer S, Dutta C, Clendaniel V et al: In vivo CRISPR base editing of PCSK9 durably lowers cholesterol in primates.Nature2021, 593(7859):429-434.

3. Koblan LW, Erdos MR, Wilson C, Cabral WA, Levy JM, Xiong ZM, Tavarez UL, Davison LM, Gete YG, Mao X et al: In vivo base editing rescues Hutchinson-Gilford progeria syndrome in mice.Nature2021, 589(7843):608-614.

4. Zuo E, Sun Y, Wei W, Yuan T, Ying W, Sun H, Yuan L, Steinmetz LM, Li Y, Yang H: Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos.Science2019, 364(6437):289-292.

5. Shuai Jin YZ, Qiang Gao, Zixu Zhu, Yanpeng Wang, Peng Qin, Chengzhi Liang, Daowen Wang, Jin-Long Qiu, Feng Zhang, Caixia Gao: Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.Science2019, 364(6437):4.

6. Koblan LW, Doman JL, Wilson C, Levy JM, Tay T, Newby GA, Maianti JP, Raguram A, Liu DR: Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction.Nature biotechnology2018, 36(9):843-846.

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